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cgm1人EB病毒轉化的B細胞
cgm1人EB病毒轉化的B細胞
復蘇注意事項：
1）收到細胞后當天換液，全部更換成客戶自己的新鮮培養基，放進培養箱，第二天再消化。
2）邊觀察邊消化，根據細胞的形態，終止消化時間，采取以半分鐘間隔吹打細胞邊緣，
如可吹打下來，即終止消化。客戶摸索消化時間。
3）隨細胞有一份細胞操作說明書，請客戶仔細查看。
4）記得加1%雙抗，降低被污染的概率。另外盡早凍存留種，以備后用。
5）售后時間為一周，僅限于細胞本身的質量問題，而因乙方自己不當操作（不規范操作，消化過度，不加雙抗導致的污染等）導致的細胞問題不在售后范疇。
6）收到細胞后，如細胞狀態不佳，或培養中遇到問題，煩請當天盡快聯系，以便處理。當天及時反饋細胞情況和細胞照片是售后跟蹤處理重要的參考依據，請您務必重視。
7）剛收到細胞時，胎牛血清可以用15%培養兩三天，利于細胞盡快恢復狀態，細胞狀態穩定后，再調回10%即可。
（其中1，2條針對于貼壁細胞，懸浮細胞詳請請見細胞操作說明書）
服務注意事項：
一）客戶收到細胞先不開蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養箱靜置2-3小時（看細胞密度而定），接著在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數拍照（建議收細胞時就整體外觀拍一張照片，觀察培養基的顏色和是否有漏液情況，隨后在顯微鏡下拍下細胞狀態，100X，200X 各一張），觀察細胞在運輸過程中是否有污染情況；
注意：細胞培養瓶中的培養液為我們公司贈品。收到細胞后，把培養方瓶里的培養基收集放置于4℃備用。剛開始培養時，建議用我們寄過去的培養基，補加2%的血清，待細胞狀態恢復后，培養液一半用我們的培養基，一半用你們的，起個過渡作用，以免細胞不適應而造成生長不好。
細胞培養常見問題分析
細胞培養
1、冷凍管應如何解凍？
取出冷凍管后， 須立即放入37 ℃水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿， 否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時， 必須注意安全， 預防冷凍管之爆裂。
2、細胞冷凍管解凍培養時， 是否應馬上去除DMSO？
除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外， 絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞）， 在解凍之后， 應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。
3、可否使用與原先培養條件不同之培養基？
不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基， 若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基， 細胞大都無法立即適應， 造成細胞無法存活。
4、可否使用與原先培養條件不同之血清種類？
不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源， 所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清， 在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。
5、何謂FBS, FCS, CS, HS ?
FBS （fetal bovine serum） 和FCS （fetal calf serum） 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用。CS （calf serum） 則是指小牛血清。HS （horseserum） 則是指馬血清。
6、培養細胞時應使用5 % 或10% CO2？或根本沒有影響？
一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統， 而培養基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養時應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細胞培養時應使用10 % CO2；當培養基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時， 則應使用5 % CO2 培養細胞。
7、何時須更換培養基？
視細胞生長密度而定， 或遵照細胞株基本數據上之更換時間，按時更換培養基即可。
8、培養基中是否須添加抗生素？
除于特殊篩選系統中外， 一般正常培養狀態下， 培養基中不應添加任何抗生素。
9、附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度？應如何處理？
一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于–20 ℃，避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機會。
10、懸浮性細胞應如何繼代處理？
一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中， 稀釋細胞濃度即可， 若培養液太多時， 可將培養角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶， 加入新鮮培養基稀釋至適當濃度， 重復前述步驟即可。
11、欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？
欲回收動物細胞， 其離心速率一般為300xg （約1,000rpm），5 - 10 分鐘， 過高之轉速， 將造成細胞死亡。
12、細胞之接種密度為何？
依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。
13、細胞冷凍培養基之成份為何？
動物細胞冷凍保存時*常使用的冷凍培養基是含5 - 10 %DMSO （dimethyl sulfoxide） 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細胞液中， 必須使用前先行配制完成。
14、DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何？
冷凍保存使用之DMSO 等級， 必須為Tissue culture grade之DMSO （如Sigma D2650）， 其本身即為無菌狀況， 次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于4°C， 避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質， 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。
15、冷凍保存細胞之方法？
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 ℃不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
15、細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？
冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。
16、應如何避免細胞污染？
細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之方法。
17、如果細胞發生微生物污染時，應如何處理？
加入相應抗生素。直接滅菌后丟棄之。
18、支原體（mycoplasma） 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？
不能。除極有經驗之專家外，大多數遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨之。
19、支原體污染會對細胞培養有何影響？
支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數， 代謝及研究之任一數據。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數據方有意義。
20、CO2 培養箱之水盤如何保持清潔？
定期（至少每兩周一次） 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。
21、為何培養基保存于4 ℃ 冰箱中， 顏色會偏暗紅色， 且pH值會越來越偏堿性？
培養基保存于4 ℃ 冰箱中， 培養基內之CO2 會逐漸溢出，造成培養基越來越偏堿性。而培養基中之酸堿指示劑（通常為phenol red） 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時， 可以通入無菌過濾之CO2， 以調整pH 值。
22、各種細胞培養用的dish，flask是否均相同？
不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對大部分細胞沒有太大之影響， 惟少數細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。
23、購買之細胞冷凍管經解凍后，為何會發生細胞數目太少之情形？ 購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？
研究人員在細胞培養時出現存活率不佳， 常見原因可歸納為：培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后， 加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于–80℃太久。
24、收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？
冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應立刻將冷凍管再一次扭緊 。
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