細(xì)胞株的復(fù)蘇是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)：
一、前期準(zhǔn)備
1. 人員與環(huán)境準(zhǔn)備
- 細(xì)胞株復(fù)蘇前，需確保操作人員具備相關(guān)的專業(yè)知識(shí)和技能，熟悉細(xì)胞株的特性及復(fù)蘇流程。操作人員應(yīng)穿戴好實(shí)驗(yàn)服、手套等防護(hù)裝備，做好個(gè)人防護(hù)。
- 細(xì)胞培養(yǎng)室應(yīng)保持清潔、無(wú)菌，提前用紫外線燈照射或甲醛熏蒸等方式對(duì)操作臺(tái)面、空氣等進(jìn)行消毒處理。同時(shí)，要調(diào)節(jié)好培養(yǎng)室的溫度和濕度，一般溫度保持在37℃左右，相對(duì)濕度在95%以上，以提供適宜的細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境。
2. 器材與試劑準(zhǔn)備
- 準(zhǔn)備好細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿、移液管、離心管、吸管、酒精燈、鑷子等實(shí)驗(yàn)器材，并確保其均已經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的滅菌處理。
- 配置好相應(yīng)的培養(yǎng)基，根據(jù)細(xì)胞株的種類選擇合適的培養(yǎng)基類型和配方，加入血清、抗生素等必要的添加劑。將培養(yǎng)基預(yù)熱至37℃，以提高細(xì)胞復(fù)蘇后的適應(yīng)能力。同時(shí)，準(zhǔn)備好胰蛋白酶等消化液，以便后續(xù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
二、復(fù)蘇操作步驟
1. 取出凍存細(xì)胞株
- 從液氮罐中小心取出含有細(xì)胞株的凍存管，注意避免凍傷。檢查凍存管是否有裂縫或破損，如有則不能使用。
2. 快速解凍
- 迅速將凍存管放入37℃的水浴中，輕輕搖晃，使凍存液盡快融化。注意不要讓水進(jìn)入凍存管內(nèi)，以免污染細(xì)胞。一般來(lái)說(shuō)，在1-2分鐘內(nèi)使凍存液融化即可。
3. 轉(zhuǎn)移細(xì)胞
- 用酒精棉球擦拭凍存管外壁，然后在超凈工作臺(tái)中打開(kāi)凍存管。用吸管將融化的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到預(yù)先準(zhǔn)備好的含有適量培養(yǎng)基的離心管中，輕輕吹打混勻。
4. 離心洗滌
- 將離心管放入離心機(jī)中，按照適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速(一般為800-1000轉(zhuǎn)/分鐘)離心3-5分鐘，去除上清液中的凍存液成分，以減少其對(duì)細(xì)胞的損傷。然后加入適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再次離心洗滌，重復(fù)2-3次。
5. 接種培養(yǎng)
- 將洗滌后的細(xì)胞沉淀用適量的培養(yǎng)基重懸，制成單細(xì)胞懸液。然后根據(jù)細(xì)胞株的生長(zhǎng)特性和實(shí)驗(yàn)需求，將細(xì)胞懸液接種到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
6. 觀察與記錄
- 在細(xì)胞復(fù)蘇后的最初幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，要密切觀察細(xì)胞的形態(tài)、貼壁情況等，判斷細(xì)胞是否復(fù)蘇成功。同時(shí)，記錄細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)、換液時(shí)間、傳代時(shí)間等信息，以便后續(xù)對(duì)細(xì)胞株的培養(yǎng)和管理。
三、注意事項(xiàng)
1.細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)盡量快速完成，減少細(xì)胞在體外暴露的時(shí)間，以提高細(xì)胞的存活率。
2. 嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則，避免細(xì)菌、真菌等微生物的污染。
3. 不同類型的細(xì)胞株可能具有不同的生長(zhǎng)特性和復(fù)蘇要求，因此在復(fù)蘇前應(yīng)充分了解細(xì)胞株的相關(guān)信息，并根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整復(fù)蘇方法和條件。
