原代細胞的分離和制作

人或動物體內（或胚胎組織）由于多種細胞結合緊密，不利于各個細胞在體外培養中生長繁殖，即使采用1mm3的組織塊，也只有少量處于周邊的細胞可能生存和生長，若需獲取大量細胞，必須將現有的組織塊充分散開，使細胞解離出來，常采用的方法如下：

一、懸浮細胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘，若懸液量大，可適當延長離心時間，但速度不能太高，延時也不能太長，以避免擠壓或機械損傷細胞，離心沉淀用無鈣、鎂PBS洗兩次，用培養基洗一次后，調整適當細胞濃度后再分瓶培養，若選用懸液中某些細胞，常采用離心后的細胞分層液，因為，經離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據需要收獲目的細胞。不同比重的分層液的配制和具體分離方法詳見淋巴細胞分離培養的章節。 

二、實體組織材料的分離方法 
對于實體組織材料，由于細胞間結合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。
（一）機械分散法
所取材料若纖維成分很少，如腦組織，部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織細胞或將已充分剪碎分散的組織放在注射器內（用九號針），使細胞通過針頭壓出，或在不銹鋼紗網內用鈍物壓擠（常用注射器鈍端）使細胞從網孔中壓擠出。此法分離細胞雖然簡便、快速，但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差。此法僅適用于處理纖維成分少的軟組織。

（二）消化分離法
組織消化法是把組織剪切成較小團塊（或糊狀），應用酶的生化作用和非酶的化學作用進一步使細胞間的橋連結構松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和大量單個細胞的細胞懸液，接種培養后，細胞容易貼壁生長。

1、酶消化分離法
酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶，其分離方法如下：
（1） 胰蛋白酶分散技術 
胰蛋白酶（簡稱胰酶）是廣泛應用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品，對蛋白質有水介作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細胞間質中的蛋白質水介而使細胞分散開，在常用的蛋白酶中由于產品的活力和純度不同，對細胞的消化能力也不同，胰蛋白酶對細胞的作用，取決于細胞類型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無機鹽離子、pH以及消化時間的長短等。
①細胞類型 胰蛋白酶適于消化細胞間質較少的軟組織,能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而對含結締組織較豐富的組織,如 乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等就無效，但若與膠原酶合用,就能增加其對組織的分離作用。
②酶的活力 市售的胰蛋白酶,其活力都經過測定而有效，但配制時必須新鮮，需保存在低溫冰箱中，消化時的pH和溫度都要適宜，否則會影響活力，細胞的分散直接與酶的活力有關，終使用活力為1:200或1:250，56℃pH8.0時活力高。
該酶為粉劑，保藏時要防潮，室內溫度不宜過高，保存時間不能太長，若粉劑結團塊,說明該部分受潮或失效。
③酶的濃度 胰蛋白酶一般采用的濃度為0.1%-0.25%(活力1:200或1:250),但遇到難消化的組織時，濃度可適當提高，消化時間適當延長。濃度高對細胞有毒性，而較低濃度的胰蛋白酶在培養液中可促進細胞的增殖，若培養液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。
④溫度 一般認為胰蛋白酶在56℃時活性相對于高于其他溫度，但由于對細胞有損害而不能被采用，常使用的溫度為37℃，通常在37℃進行消化比室溫作用快。
⑤pH pH8~pH9是胰蛋白酶活力適宜范圍，但隨堿性的增加其活力也隨之減少，活性強分散快，細胞也容易被消化下來，消化分離細胞時PH只能選用7.6～8.0之間，否則對細胞有損傷。
⑥無機鹽離子 若用含有鈣和鎂的鹽類溶液來配制胰蛋白酶時，可以發生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制時應采用無鈣鎂離子的PBS配制。
⑦消化時間 如果細胞消化時間過長，可以損害細胞的呼吸酶，從而影響細胞的代謝，一般消化時間為20分鐘為宜，冷消化時使用低濃度消化液，于4℃過夜也可。
分離方法如下：
①過夜冷消化 將取得的組織用Hanks液洗三次，剪成碎塊大小為4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪組織，再加入0.25%的胰蛋白酶，搖勻后放4℃過夜，次日再用Hanks液洗滌，棄去上清，共洗2~3次，然后，加入少量營養液吹打分散，細胞計數，按適當的濃度分瓶培養。
②多次提取消化法 多次提取消化法有以下三種：
熱消化多次提取 將剪碎的細胞塊加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分鐘，然后經洗滌后用營養液分散制成細胞懸液，按合適的濃度分瓶培養，然后將留下的未*消化的組織按上述方法操作，再消化提取細胞。
冷消化多次提取 方法同上，只是消化溫度為4℃。
先熱消化后冷消化 將組織塊先用胰蛋白酶于37℃下消化20分鐘經洗滌后用營養液分散，制成懸液，剩余未消化的小組織塊經洗滌后用胰酶于4℃下過夜，次日再提取細胞，分散成懸液，分瓶培養。

（2） 膠原酶（Collagenase）消化法 
膠原酶是一種從細菌中提取出來的酶，對膠原有很強的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細胞間質有較好的消化作用，對細胞本身影響不大，可使細胞與膠原成分脫離而不受傷害。該酶分離效果好，即使有鈣、鎂離子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培養液配制，即操作簡便又可提高細胞成活率，終濃度200u/mL或0.1～0.3mg/mL。此酶消化作用緩和，無需機械振蕩，但膠原酶價格較高，大量使用將增加實驗成本。
經過膠原酶消化后的上皮組織，由于上皮細胞對酶有耐受性，可能有一些上皮細胞團塊尚未被*消化開。成小團塊的上皮細胞比分散的單個上皮細胞更易生長，因此不必要再進一步消化處理。
鑒于胰蛋白酶和膠原酶的生物學活性（見表4-1）和在不同濃度下消化各種組織小塊所需的時間（小時）有差異（見表4-2），以及兩者價格不等，有人采用膠原酶與胰蛋白酶并用，同時還可加透明質酸酶（對細胞表面糖基有作用），采用兩者的聯合消化作用，對分散大鼠和兔肝、癌組織非常有效。

表4-1 胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別
項 目 胰蛋白酶 膠原酶
消化特性 適用于消化軟組織 適用于消化纖維多的組織
用 量 0.01%～0.5% 0.1～0.3mg/mL(200u/mL)
消化時間 0.5～2小時（小塊） 1～12小時
pH 8～9 6.5～7.0
作用強度 強烈 緩和
細胞影響 時間過長有影響 無大影響
血清、鈣、鎂離子 有影響 無影響

表4-2 胰蛋白酶和膠原酶在不同溫度下消化各種組織小塊時所需時間(小時)(0.5～1cm3)
酶 種 類 較 硬 組 織 軟 組 織
4℃ 室 溫 37℃ 4℃ 室 溫 37℃
胰蛋白酶(0.25%) 24～48 1～6 1～2 12～24 1～2 0.5～1
膠原酶(200u/mL) 24 6 6.5 12 3 0.25
兩者聯合 12～46 12～24 4～12 12～24 6～12 1～2

除上述兩種消化酶外，還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶，近年來，還有一種從灰霉菌中提取的Pronase新酶分散細胞更佳。
2、非酶消化法（EDTA消化法）
EDTA是一種非酶消化物，又稱螯合劑或Versene，全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學物質能與細胞上的鈣、鎂離子結合形成螯合物，利用結合后的機械力使細胞變圓而分散細胞或使貼壁細胞從瓶壁上脫離，缺點是細胞易裂解或貼壁細胞從瓶壁上脫離時呈片狀，有團塊，常不單獨使用，但可與胰蛋白酶混合使用（1:1或2:1），不僅利于細胞脫壁又利于細胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。
消化分離法的操作步驟：
（1）剪切 把組織塊剪碎，呈1~5mm3大小的組織塊。
（2） 加液漂洗 將碎組織塊在平皿（或三角燒瓶）中用無鈣鎂PBS洗2-3次（采用傾斜，自然沉降法）。
（3）消化 加入消化液（胰蛋白酶或膠原酶或EDTA）于37℃水浴中作用適當時間（中間可輕搖1~2次），若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續消化直至膨松絮狀為止。胰蛋白酶消化時間不宜過長。
（4）棄去消化液 采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。
（5）漂洗 將含有鈣、鎂離子的培養基沿瓶壁緩緩加入，中止消化反應，采用漂洗法洗2-3次后，加入*培養基。
（6）機械分散 采用吸管吹打或振蕩法，使細胞充分散開后用紗網或3~4層無菌紗布過濾后分瓶培養，若要求不高可采用傾斜自然沉降5~10分鐘，吸上層細胞懸液進行分瓶培養。
注意事項如下：
（1）組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。
（2）胰蛋白濃度不宜過高，作用時間不能太長，以避免毒性作用。
（3）消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產生，而且動作要輕，以避免膨松的細胞隨漂洗而丟失。