細(xì)胞凍存技術(shù)

實(shí)驗(yàn)室低溫保存設(shè)備包括：液氮保存箱、液氮罐、-140℃/-150℃深冷低溫保存箱、-86℃超低溫冰箱、程控降溫儀、低溫冰箱（-20℃、-30℃、-40℃）、藥品保存箱、疫苗保存箱、血庫冰箱、層析柜、防爆冰箱、防火冰箱等。

檢驗(yàn)冰箱可靠性和制冷能力的方法：1、常規(guī)冰箱放置溫度計(jì)；2、超低溫冰箱放置加熱器、大量樣品或反復(fù)開門
 
 1. 凍存保護(hù)劑
很多化合物都可以作為凍存保護(hù)劑，它們既可以單獨(dú)使用也可以聯(lián)合使用，例如糖、血清和去污劑。雖然凍存沒有的準(zhǔn)則，但是大家普遍認(rèn)為二甲基亞砜（DMSO）和甘油是保護(hù)活細(xì)胞和組織使用廣泛且有效的凍存保護(hù)劑。其他凍存保護(hù)劑可根據(jù)情況使用，可單獨(dú)使用也可聯(lián)合使用，包括：聚乙烯乙二醇（polyethylene glycol），丙烯乙二醇（propylene  glycol），甘油（glycerine），聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrolidone），山梨醇（sorbitol），右旋糖苷（dextran），海藻糖（trehalose）。

凍存組織和整個(gè)器官的需求，促進(jìn)了凍存方法的發(fā)展，新方法也提高了凍存細(xì)胞和有機(jī)體的復(fù)蘇。這些方法包括改變凍存保護(hù)劑的濃度和加入添加劑，避免凍存過程引發(fā)的細(xì)胞調(diào)亡或 程序性死亡。多年來人們一直認(rèn)為，是凍存過程中產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)物理變化或損壞，造成凍存后細(xì)胞的死亡。而近有研究發(fā)現(xiàn)，一些更為精細(xì)的胞內(nèi)活動(dòng)可能導(dǎo)致了細(xì)胞死亡，而這些活動(dòng)可在一定程度上受控于適當(dāng)?shù)膬龃嫣砑觿?/p>

凍存過程中，凍存保護(hù)劑有多種功能。例如，DMSO 可以降低冰點(diǎn)，促進(jìn)細(xì)胞在胞內(nèi)冰晶形成之前脫水更加*。普遍認(rèn)為，當(dāng)凍存保護(hù)劑可有效穿透細(xì)胞，延遲胞內(nèi)冰晶形成，降低溶液效應(yīng)時(shí)，凍存保護(hù)的效果不錯(cuò)。另外，需要根據(jù)凍存的細(xì)胞類型來選擇凍存保護(hù)劑。對(duì)絕大多數(shù)細(xì)胞來說，甘油是更好的選擇，因?yàn)樗亩拘员菵MSO 小。但是，DMSO 具有更好的滲透性， 通常作為較大型較復(fù)雜的細(xì)胞凍存，如原生生物。在添加到細(xì)胞懸液之前，凍存保護(hù)劑應(yīng)該用新鮮培養(yǎng)基稀釋到適宜濃度，這能小化潛在的化學(xué)反應(yīng)損害，并確保細(xì)胞能均一接觸到保護(hù)劑，減少毒害效應(yīng)。DMSO 和甘油通常使用的濃度范圍為 5-10%（v/ v）。除了用于植物細(xì)胞，二者一般不聯(lián)合使用。

凍存保護(hù)劑濃度選擇根據(jù)細(xì)胞類型及細(xì)胞所能耐受的濃度而定。針對(duì)某些材料，通過不斷增加保護(hù)劑濃度來檢測細(xì)胞的敏感度，有助于挑選出保護(hù)劑的工作濃度。Quick- Reference Chart（第4 頁）羅列出針對(duì)不同類型細(xì)胞所使用保護(hù)劑的推薦濃度，并且可以作為選擇合適保護(hù)劑的參考資料。

2. 生物材料準(zhǔn)備
生物材料凍存前進(jìn)行的準(zhǔn)備工作可能會(huì)對(duì)凍存結(jié)果產(chǎn)生影響。對(duì)于非復(fù)制性材料，如組織，核酸和蛋白等，準(zhǔn)備過程包括確認(rèn)生物材料處于合適的溶液或凍存培養(yǎng)基中，此步驟的目的在于復(fù)蘇時(shí)達(dá)到大化的預(yù)期用途。然而，活細(xì)胞和微生物的穩(wěn)定性及復(fù)蘇活力受生長條件和凍存前準(zhǔn)備工作的影響。

細(xì)胞凍存前需考慮多種因素，包括細(xì)胞類型、活力、生長條件、生理狀態(tài)、數(shù)目以及細(xì)胞前處理等。當(dāng)建立一個(gè)新分離株或細(xì)胞系的初次種子儲(chǔ)備時(shí)，必須對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行檢測并消毒，確保微生物污染的小化。每次準(zhǔn)備工作后，以及每次準(zhǔn)備新批次的培養(yǎng)物時(shí)，均要重復(fù)這個(gè)步驟。

2、1 微生物
生長于通氣培養(yǎng)條件下的微生物細(xì)胞，特別是細(xì)菌和酵母，表現(xiàn)出比生長于非通氣條件下的細(xì)胞更強(qiáng)的耐受冷卻和凍存?zhèn)?nbsp;的能力。T.Nei 認(rèn)為，在通氣培養(yǎng)條件下，細(xì)胞通透性更好，且開放條件下培養(yǎng)細(xì)胞在冷卻過程中比非通氣條件下培養(yǎng)的細(xì)胞失水更快。另外，針對(duì)微生物細(xì)胞，在對(duì)數(shù)生長期后期及穩(wěn)定期早期獲得的細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的冰凍耐受性。從生長后期和靜態(tài)培養(yǎng)早期收集的微生物細(xì)胞比生長早期和生長晚期的細(xì)胞表現(xiàn)了更強(qiáng)的冰凍耐受性。

一般來講，初始凍存的細(xì)胞數(shù)目越多，復(fù)蘇率越高。對(duì)于大多數(shù)細(xì)菌和酵母而言，保證約 107/ml 的細(xì)胞數(shù)才能確保足夠數(shù)量的細(xì)胞復(fù)蘇。由于這些細(xì)胞可便捷地從瓊脂培養(yǎng)板或斜面上收集，如果需要更大量的細(xì)胞，也可使細(xì)胞生長于液體培養(yǎng)基中通過離心收集，在任何一種情況下，細(xì)胞通常懸浮在包含凍存保護(hù)劑的新鮮培養(yǎng)基中。原生生物可以通過離心濃縮，但通常需要懸浮于使用的培養(yǎng)基中，之后使用等體積含凍存保護(hù)劑的新鮮培養(yǎng)基稀釋。

針對(duì)芽孢菌凍存，需要收集芽孢并重懸于含凍存保護(hù)劑的新鮮培養(yǎng)基中。凍存前，必須縮短操作時(shí)間且確保芽孢并未萌發(fā)。針對(duì)非芽孢菌凍存，凍存前需采用特殊程序收集菌絲體。某些具硬菌絲體的真菌，需將含有菌絲體的瓊脂塊從培養(yǎng)基中切出，并將其置于含凍存保護(hù)劑的新鮮培養(yǎng)基中。硬菌絲體無法與瓊脂培養(yǎng)基很好粘附，生長于肉湯培養(yǎng)基中時(shí)，凍存前需將菌絲體團(tuán)進(jìn)行混合。

凍存材料的活力和復(fù)蘇率由凍存前后的培養(yǎng)和生長狀態(tài)決定。活力是衡量培養(yǎng)物生長和繁殖的一項(xiàng)指標(biāo)。例如原生生物材料等某些材料，需經(jīng)過多次傳代才能保證其穩(wěn)定性。復(fù)蘇細(xì)胞數(shù)量的估算有多種方法，包括連續(xù)稀釋，平板計(jì)數(shù)或直接細(xì)胞計(jì)數(shù)。通過對(duì)比凍存前和復(fù)蘇后細(xì)胞數(shù)量的差異，可說明細(xì)胞復(fù)蘇程度 或凍存過程是否成功。

2、2 哺乳動(dòng)物細(xì)胞
哺乳動(dòng)物細(xì)胞準(zhǔn)備凍存時(shí)，需要將細(xì)胞調(diào)整到合適生長狀態(tài)， 確保既能得到足夠的復(fù)蘇細(xì)胞又無大量非必需生長的細(xì)胞。對(duì)大部分哺乳動(dòng)物細(xì)胞來說，起始細(xì)胞數(shù)為 106-107/ml 左右。為方便加入等體積的凍存保護(hù)劑（2× 凍存保護(hù)劑 + 培養(yǎng)基），細(xì)胞懸液濃度應(yīng)以起始濃度的兩倍準(zhǔn)備。或者，也可將沉淀細(xì)胞重懸在凍存 保護(hù)劑（1× 凍存保護(hù)劑 + 培養(yǎng)基）中達(dá)到預(yù)期細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞操作應(yīng)該溫和小心，確保細(xì)胞在凍存前是健康的。盡量避免劇烈吹打及 高速離心。適當(dāng)情況下，可注入 5% 或 10% CO2 來調(diào)節(jié) pH。
影響哺乳動(dòng)物細(xì)胞復(fù)蘇的因素包括：（a）細(xì)胞類型，（b）生長階段，（c）細(xì)胞處于細(xì)胞周期的哪個(gè)階段，（d）終懸液中的細(xì)胞數(shù)量和濃度。可通過優(yōu)化以上因素來提高復(fù)蘇細(xì)胞活力， 另外，還需考慮凍存保護(hù)劑的特性以及凍存過程的具體操作。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)其他細(xì)胞和微生物的污染特別敏感，例如 Hela 細(xì)胞。由于這種特性，初始細(xì)胞系可通過同工酶分析、染色體組型分析、免疫分析或基因組分析，檢測來源。凍存前后均應(yīng)該進(jìn)行如上檢測。特別需要注意的是，病毒和支原體污染。 一套完整健全的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系鑒定程序應(yīng)該包括，檢查是否存 在細(xì)菌、真菌、病毒、支原體、甚至原生生物細(xì)胞的污染。

2、3 干細(xì)胞
干細(xì)胞的凍存方式與哺乳動(dòng)物細(xì)胞大體類似，除了部分提高復(fù)蘇和克隆生長活性的步驟。一般使用 DMSO 為凍存保護(hù)劑，有時(shí)配合使用血清，推薦緩慢降溫方式凍存。海藻糖與其它凍存保護(hù)劑聯(lián)合使用，降低對(duì)細(xì)胞的潛在傷害。同時(shí)，推薦快速升溫方式復(fù)蘇。復(fù)蘇的細(xì)胞活力依據(jù)細(xì)胞類型不同可能呈現(xiàn)不同水平。

玻璃化（Vitrification）也可被用于凍存干細(xì)胞。操作流程包括，懸浮細(xì)胞于包含多種凍存保護(hù)劑的濃縮混合物中。另外，需要降溫凍存和復(fù)蘇過程的操作均十分快速，避免冰晶的形成。一些研究證明，玻璃化可得到更高的細(xì)胞活力。DMSO，甘油和丙二醇為常用的有效凍存干細(xì)胞的保護(hù)劑。

2、4 植物細(xì)胞
植物細(xì)胞凍存與其它細(xì)胞相似。細(xì)胞的生長階段會(huì)影響復(fù)蘇效果，適合的生長階段為對(duì)數(shù)生長期后期。另外，細(xì)胞密度也大大影響復(fù)蘇效果，合適細(xì)胞密度取決于細(xì)胞類型。
聯(lián)合使用凍存保護(hù)劑大多數(shù)情況下比單一使用效果更好。降溫速率很重要，在很多情況下，兩步降溫法*，即先將細(xì)胞在 -30℃ --40℃凍存一段時(shí)間再降溫到液氮溫度。這種方法增強(qiáng)了凍存前的胞質(zhì)失水。通常推薦快速回溫方式復(fù)蘇，但是在某 些情況下緩慢回溫方式復(fù)蘇效果更好。通過使用濃縮細(xì)胞懸液和快速降溫，植物細(xì)胞也可使用玻璃化方式凍存。

植物的抗逆性培養(yǎng)使得其對(duì)于壓力環(huán)境有更強(qiáng)的耐受性，例如凍存過程。植物可產(chǎn)生一定數(shù)量的化合物，例如糖類或甘油，保護(hù)細(xì)胞減少滲透壓改變?cè)斐傻膫ΑＮ捶只鷤M織凍存通常是為了獲得穩(wěn)定性狀，這些性狀會(huì)被持續(xù)培養(yǎng)所影響。

種子保存也是一種保存穩(wěn)定植物種質(zhì)（germplasm）的方法， 普遍的方法為保存于低濕低溫處。然而，有些種子可耐受由凍存引發(fā)的失水，這樣的種子便可凍存于液氮溫度中。

2、5 病毒
大多數(shù)病毒可以無準(zhǔn)備階段直接凍存，且無需進(jìn)行降溫控制。但是，與寄主細(xì)胞同培養(yǎng)的病毒，在凍存過程中需要進(jìn)行降溫控制。就寄宿細(xì)胞的病毒而言，應(yīng)采取適當(dāng)?shù)膬龃娌僮饕员ＷC宿主細(xì)胞的活力。當(dāng)從卵細(xì)胞中獲得病毒時(shí)，尿囊液或卵黃囊中的高蛋白物質(zhì)可在凍存過程中對(duì)其提供保護(hù)。

植物病毒的保存既可以通過感染植物組織的方式，也可以是純病毒制劑形式。病毒準(zhǔn)備是在凍存前將其懸浮于 DMSO 或其它 凍存保護(hù)劑中。雖然絕大部分植物病毒可耐受快速降溫，但適當(dāng)控制降溫速率，可得到很好復(fù)蘇效果。直接在溫水浴中浸泡便 可對(duì)植物病毒進(jìn)行復(fù)蘇，之后將復(fù)蘇病毒接種于合適植物寄主即可。

2、6 胚胎
胚胎可通過控制降溫速率和玻璃化兩種方式進(jìn)行保存。復(fù)蘇取決于胚胎發(fā)育的階段，通過成功植入并進(jìn)入胎兒發(fā)育來衡量復(fù)蘇效果。

2、7 非復(fù)制性材料
非復(fù)制性材料，例如全血、血清、組織、核酸和蛋白質(zhì)，對(duì)于材料的凍存并無特殊要求。這些材料一般直接凍存，不加凍存保護(hù)劑，且采用快速降溫。然而，對(duì)于這些材料的實(shí)際凍存操作方式的選擇取決于材料終的使用目的。要在復(fù)蘇后成功保留全血的特性，需要凍存保護(hù)劑和降溫控制，而凍存組織的質(zhì)量提高可以通過使用切割溫度（OCT）復(fù)合物材料等物質(zhì)進(jìn)行懸浮。